課程42
中藥材（飲片）鑒別及質(zhì)量控制
中藥材（飲片）質(zhì)量控制的目標
1.全面提高和完善中藥材（包括民族藥）、中藥飲片質(zhì)量標準，重點研究道地藥材與非道地藥材、野生與栽培藥材品質(zhì)的特異性和常用中藥材專屬性檢測方法，深入研究并建立能有效控制中藥材及中藥飲片質(zhì)量的方法。
2.建立符合中醫(yī)藥特點的質(zhì)量標準體系，逐步由單一指標性成分定性定量向活性、有效成分及生物測定的綜合檢測過渡，向多成分及和指紋或特征圖譜整體質(zhì)量控制模式轉(zhuǎn)化。
3.重點增加和完善中藥安全性檢測方法；增強檢測方法的專屬性；建立科學合理的控制指標。
    一、標準制定的原則與技術要求
    中藥特點：功能主治廣泛，物質(zhì)基礎復雜，易于摻雜、造假，質(zhì)量控制難度大。
因此，中藥質(zhì)量控制是藥品質(zhì)量控制的難點和熱點。
中藥材、飲片的質(zhì)量標準是中藥質(zhì)量標準的基礎，也是確保臨床湯劑和中成藥質(zhì)量的關鍵。
中藥化學成分研究的現(xiàn)狀
1.對中藥化學成分、特別是有效成分的研究還遠遠不夠，對很多中藥藥效物質(zhì)的了解只是一知半解：如人參、地黃。
   2.化學成分與功效不相關，或相關性不大；如板藍根、蟲草
   3.專屬性不強，如綠原酸、槲皮素、熊果酸、氨基酸 
   4.指標成分含量很低，難以代表中藥的整體療效：1%,        0.1%, 0.01%,
   5.量效關系不清楚 
   6.完全未知或基本不清楚
中藥材（飲片）質(zhì)量標準建立的基本要素
    科學性
    分析、檢定方法達到辨別真?zhèn)巍⒃u價優(yōu)劣的目的
    指標成分的有無或含量高低能夠反映分析對象藥物的內(nèi)在品質(zhì)
    測定值最大限度地接近真值
    先進性
    反映藥物研究的最新進展（各國藥典, 最新的文獻）
    儀器設備自動化程度高
    適用性
    簡便
    快速
    經(jīng)濟
安全
普及
中藥材（飲片）質(zhì)量標準基本內(nèi)容
 中藥材、飲片質(zhì)量標準基本內(nèi)容：
名稱
來源
性狀
鑒別
檢查
含量測定
炮制
性味與歸經(jīng)
功能與主治
用法與用量
注意
貯藏
樣品的收集
    考證來源、產(chǎn)地、資源情況
收集代表性樣品
對于容易區(qū)分的多來源品種，每種來源都要收集3～5批樣品，單來源的品種至少應收集10批以上
避免由同一供貨渠道收集實際為一批樣品的“多批樣品”
注意收集該品種的易混偽品供比較研究用
收集的藥材樣品應標明產(chǎn)地、收集地、收集時間等。
新增藥材品種要求附帶2份臘葉標本，臘葉標本須經(jīng)相關專家簽名鑒定
取樣
 一般性了解：藥材的品名、產(chǎn)地、批號、規(guī)格等級以及包件式樣是否符合要求。
 一般性檢查：包件的完整性、清潔程度、有無水跡、霉爛或污染等異常情況，發(fā)現(xiàn)有腐敗、霉壞、嚴重蟲蛀情況或色、嗅、味顯著異常的藥材應另行取樣。
 一般取樣方法：5件以下，逐件取樣；5～99件，抽5件；100～1000件，抽5％；超過1000件部分，再抽1％；
貴重藥材：逐件抽樣。
破碎、粉末藥材：在2～3個不同部位取樣。
 取樣量：一般藥材100～500g；粉末藥材：25～50g；貴重藥材：5～10g；個體重量較大的藥材：適當增加取樣量。
最終取樣量必須大于全檢需要量的3倍。
中藥材（飲片）命名
1. 中藥材的名稱與命名原則
包括中文名、漢語拼音及拉丁名。
歷代本草
中藥大辭典
中華本草
地方藥材標準
地方草藥匯編
中國植物志
地方植物志
2. 炮制品的名稱與命名原則
炮制品的名稱應與藥材名稱相呼應，如炙黃芪、蜜麻黃、熟地黃。
中藥材來源包含的內(nèi)容
植動物藥材：原植(動)物的科名、植(動)物的中文名、拉丁學名、藥用部位、采收季節(jié)、產(chǎn)地加工和藥材傳統(tǒng)名稱；
礦物藥：礦物的類、族、礦石名或巖石名、主要成分及產(chǎn)地加工。
參考依據(jù)：
Flora of China
中國高等植物
中國植物志
地方植物志
新編中藥志
常用中藥材品種整理和質(zhì)量研究
《中國藥典》中部分拉丁學名已被調(diào)整，被調(diào)整的拉丁學名可作為異名標示，如祁州漏蘆Stemmacantha uniflora Dittrich （Rhaponticum uniflorum (L.) DC.）。
此類調(diào)整必須慎重，《中國藥典》須保持相對的穩(wěn)定，允許相對滯后。對于非公認的較新的過細的分類研究結(jié)果不宜急于跟進、盲目采用。
1. 基原(Origin)的確定
本草考證
產(chǎn)地調(diào)查與基原鑒定
市場調(diào)查
丁公藤注射劑原料藥材的鑒定研究
《中國藥典》（2005年版 一部）：丁公藤為旋花科植物丁公藤Erycibe obtusifolia Benth.及光葉丁公藤E. schmidtii Craib的藤莖。
  現(xiàn)行標準：東莨菪內(nèi)酯定性、定量分析，無法區(qū)分正品、偽品。
2.采收時間
采收時間如必須控制在某生長階段的，則應明確規(guī)定，如“花盛開時采收”、“枝葉茂盛時采收”。
有的品種對采收時間段雖不十分敏感，但某生長階段的采收質(zhì)量相對較好，則可規(guī)定為“全年均可采收，以枝葉茂盛時采收為佳”等。
道地藥材的采收時間較為明確，應盡量清楚記述，如藥材白芷：“川白芷6月，禹白芷8月，祁白芷9月，--- 采挖”。
凡全年均可采收，對藥材質(zhì)量無影響者，規(guī)定為“全年均可采收”。
3.產(chǎn)地加工
主要規(guī)定藥材采收后進行加工處理的基本要求。
有的藥材由于地區(qū)習慣不同，加工的方法不一，盡可能選擇能確保質(zhì)量具有代表性的一種方法，必要時也可列兩種方法。
如果是在產(chǎn)地加工成片(段)，應在起草說明中明確。
加工處理應重點注明以下方法，如“烤干”、“趁鮮切片后干燥”、“開水略燙后干燥”、“刮去外皮后干燥”等。
 性狀描述與檢驗
1. 性狀鑒定與檢驗的一般方法
“性狀”系指藥材和飲片的形狀、大小、色澤、表面、質(zhì)地、斷面(包括折斷面或切斷面)及氣味等特征。
按藥材、飲片的實際形態(tài)描述，描述要抓主要特征，文字要簡練，用語要準確。
觀察方法主要是運用感官來鑒別，如用眼看(較細小的可借助于擴大鏡或解剖鏡)、手摸、鼻聞、口嘗等方法。
多植(動)物來源的藥材，其性狀無明顯區(qū)別者，可合并描述；有明顯區(qū)別者，應分別描述。
無論是根、根莖、藤莖、大果實、皮類藥材，應盡量多描述斷面特征，以便進行破碎藥材或飲片的性狀鑒別，也可避免飲片性狀的重復描述內(nèi)容。
         1. 形狀是指藥材和飲片的外形。觀察時一般不需預處理，如觀察很皺縮的全草、葉或花類時，可先浸濕使軟化后，展平，觀察。觀察某些果實、種子類時，如有必要可浸軟后，取下果皮或種皮，以觀察內(nèi)部特征。
描述用語以現(xiàn)代術語為主。對傳統(tǒng)經(jīng)驗中形容藥材特征的形象化詞匯，可結(jié)合現(xiàn)代術語描述，如海馬傳統(tǒng)經(jīng)驗的“馬頭蛇尾瓦楞身”，描述為“頭略似馬頭，……體上有瓦楞形的節(jié)紋……”。
 
  2. 大小是指藥材和飲片的長短、粗細(直徑)和厚薄。一般應測量較多的供試品，可允許有少量高于或低于規(guī)定的數(shù)值。超出或低于規(guī)定范圍樣品的數(shù)量占總量的比例不得過20%；超出和低于規(guī)定范圍樣品的數(shù)量之和占總量的比例不得過30%。測量時應用毫米刻度尺。對細小的種子或果實類，可將每10粒種子緊密排成一行，以毫米刻度尺測量后求其平均值。
 
  3. 色澤是指在日光下觀察的藥材和飲片顏色及光澤度。如用兩種色調(diào)復合描述顏色時，以后一種色調(diào)為主。例如黃棕色，即以棕色為主。
  4. 觀察藥材或飲片表面特征、質(zhì)地和斷面特征時，供試品一般不作預處理。如折斷面不易觀察到紋理，可削平后進行觀察。
 5. 檢查藥材或飲片氣味時，可直接嗅聞，或在折斷、破碎或搓揉時進行。必要時可用熱水濕潤后檢查。
  6. 檢查藥材或飲片味感時，可取少量直接口嘗，或加熱水浸泡后嘗浸出液。有毒藥材及飲片如需嘗味時，應注意防止中毒。
  7. 藥材和飲片外觀不得有蟲蛀、發(fā)霉、其他物質(zhì)污染等異常現(xiàn)象。
特別注意中藥栽培品性狀的變化。
  如:黃芩【性狀】 本品呈圓錐形，扭曲，長8～25cm，直徑1～3cm。表面棕黃色或深黃色，有稀疏的疣狀細根痕，上部較粗糙，有扭曲的縱皺或不規(guī)則的網(wǎng)紋，下部有順紋和細皺。質(zhì)硬而脆，易折斷，斷面黃色，中心紅棕色；老根中心呈枯朽狀或中空，暗棕色或棕黑色。氣微，味苦。
栽培品較細長，多有分枝。表面淺黃棕色，外皮緊貼，縱皺紋較細膩。斷面黃色或淺黃色，略呈角質(zhì)樣。味微苦。
 例貓爪草：本品呈紡錘形，多5～6個簇生，形似貓爪，長3～10mm，直徑2～3mm，頂端有黃褐色殘莖或莖痕。（2005年版）
 本品由數(shù)個至數(shù)十個紡錘形的塊根簇生，形似貓爪，（2010年版）
鑒別
      系指鑒別藥材、飲片真?zhèn)蔚姆椒?，包括?jīng)驗鑒別、顯微鑒別、理化鑒別。
所建立的鑒別項目應符合總則的要求，并應盡可能區(qū)別同類相關品種或可能存在的易混淆品種。
對無專屬性、重現(xiàn)性差的項目，盡量不予收載。
 
鑒別常用的方法 1. 經(jīng)驗鑒別：是用傳統(tǒng)的實踐經(jīng)驗，對藥材的某些特征，采用直觀方法進行鑒別真?zhèn)蔚姆椒?。應先描述試驗的方法，再描述試驗產(chǎn)生的現(xiàn)象和結(jié)果。
例 青黛  取本品少量，用微火灼燒，有紫紅色的煙霧產(chǎn)生。又如牛黃  取本品少量，加清水調(diào)和，涂于指甲上，能將指甲染成黃色，習稱“掛甲”。其他如秦皮（熒光）、車前子（黏液）、菟絲子（吐絲）
2. 顯微鑒別
定義：系指用顯微鏡對藥材(飲片)切片、粉末、解離組織或表面制片和顯微化學進行鑒別的一種方法。
歷史：顯微鑒別來源于植物解剖學。我國生藥顯微鑒別研究始于上世紀五十年代初，經(jīng)歷了幾十年的研究發(fā)展，特別是近年來顯微鑒定技術與計算機多媒體技術結(jié)合，
顯微鑒定技術發(fā)生了質(zhì)的飛躍，顯微特征不再微小、難以掌握；現(xiàn)今顯微鑒別已成為我國藥典藥材和中成藥鑒別的重要方法之一。
顯微鑒定作為生藥標準：《中國藥典》、《香港中藥材標準》、《日本藥局方》、《印度草藥典》、《英國藥典》、《美國藥典》、《European Pharmacopoeia》(歐洲藥典) 。
(一)切片標本片的制法
1、徒手切片法 材料的預處理：清洗材料→軟化(堅硬材料)
切片：左手拇指和食指夾持材料，中指托住材料，使材料略高出食拇二指，肘關節(jié)靠在桌沿，材料的切面保持水平。右手執(zhí)刀片，刀口向內(nèi)，并使刀刃與材料的切面平行，移動右臂使刀鋒自左前方向右后方向切削。切片過程中經(jīng)常加水，保持濕潤。切出的薄片放在盛有蒸餾水或50％乙醇溶液的培養(yǎng)皿中，讓切片展開。
2、滑走切片法 3、冰凍切片法  4、石蠟切片法
(二)粉末標本片的制片方法
1、粉末的制備
粉碎機粉碎：取藥材樣品，清除表面的泥沙和雜質(zhì)，必要時干燥，切成1～5mm小片，置粉碎機中粉碎，過60目篩。對于難以粉碎的纖維，篩出后單獨粉碎，再混入藥粉中。
乳缽研磨：取藥材樣品，清除表面的泥沙和雜質(zhì)，切成1mm左右的小片，置乳缽中，研磨，即得。
刀片刮?。鹤笫帜粗概c食指握住藥材，右手拿刀片，從藥材表面輕輕刮取粉末。
2、制片
用解剖針挑取少量的粉末，置載玻片中央偏右，加入水合氯醛，用解剖針或玻棒攪勻，加熱，透化，加稀甘油，加蓋玻片，擦拭干凈，即得。
觀察淀粉粒、菊糖、糊粉粒等，用水或稀甘油直接裝片。
(三)表面片的制法
一般葉類中藥材需要制備表面片
整體封片法：對于很薄的葉子或花冠等，可整體封片。方法為將葉子鋪在玻璃片上，用刀片切取欲觀察的部分，一般4mm見方，一正一反，放在載玻片上。下同切片的制法。
表皮撕離法：將葉子用水浸泡軟化后，左手食指托住葉子，拇指和中指壓住葉子的兩端，右手拿鑷子，撕出葉子的表面，放在水或50％乙醇的培養(yǎng)皿中。以下操作用切片。
(四)解離片的制法
 將藥材切成直徑約2mm、長約1cm的小條，置試管中，加5％氫氧化鉀溶液適量，在沸水浴中加熱至用玻棒擠壓材料即能離散為止。傾去堿液，材料用水洗滌，取少許材料，置載玻片上，加稀甘油封藏，即成。
(五)顯微化學反應
木化細胞壁：＋間苯三酚試液→放置2～3min →＋鹽酸→紅色
木栓化或角質(zhì)化細胞壁：＋蘇丹Ⅲ →放置片刻→桔紅色～紫紅色
淀粉粒：＋碘液→藍色～紫色
脂肪油、揮發(fā)油、樹脂：＋蘇丹紅→桔紅色～紫紅色
  粘液質(zhì)：＋釕紅→紅色
蛋白質(zhì)和糊粉粒：＋碘液→黃棕色
菊糖：＋α-萘酚→1～2min →＋80％硫酸→紫色而溶解
草酸鈣結(jié)晶：＋稀鹽酸→溶解，無氣泡；＋20％硫酸→ 溶解，無氣泡→ 轉(zhuǎn)變?yōu)獒槧罱Y(jié)晶；＋稀醋酸→不溶解
碳酸鈣結(jié)晶：＋稀鹽酸→溶解，發(fā)生氣泡；＋20％硫酸→ 溶解，發(fā)生氣泡→ 轉(zhuǎn)變?yōu)獒槧罱Y(jié)晶；＋稀醋酸→溶解，發(fā)生氣泡
 3. 一般理化鑒別
    取藥材粉末，用溶劑提取或處理后，制備供試液，再加入規(guī)定的試藥或試液，觀察其顯色或沉淀等反應。
(1) 顯色反應  (2) 沉淀反應  (3) 熒光鑒別
 4. 光譜鑒別
礦物藥的某些光譜特征，可作為鑒別的依據(jù)。
其它藥材、飲片當無法建立專屬性鑒別時，如含有的化學成分在紫外或可見光區(qū)有特征吸收光譜，也可作為鑒別的依據(jù)。
鑒別特征可采用測定最大吸收波長，如有2～3個特定吸收波長時，可測定各波長吸收度的比值。
5. 色譜鑒別
(1) 薄層色譜
(2) 高效液相色譜
特征圖譜
指紋圖譜
(3) 氣相色譜
(4) 毛細管電色譜
薄層色譜法
  薄層色譜法具有分離與鑒定的雙重功能，通過薄層圖譜與對照品、對照藥材的圖譜相比較，除了能鑒別出有效成分或特征成分外，還以完整的色譜圖作為一個整體對制劑加以鑒別，提高了鑒別的準確性，尤其當有效成分尚不確切時，更顯示出薄層色譜法的實用性。
  鑒于單一化學對照品不能反映藥材的整體特征，一些多種植物共存的化學成分沒有專屬性，以及沒有化學對照品鑒別就無法進行的問題，從1990版藥典起，薄層色譜鑒別除有化學對照品作為鑒別藥材的指標成分以外，開始增加了“對照藥材”，以藥材的色譜整體為特征進行對比鑒別，解決了上述存在的問題。
  薄層色譜分析法適用于微量樣品的分離、鑒定和制備。在中藥制劑制備過程中，經(jīng)適宜的工藝來取舍處方中各藥材的各類成分，從而達到保持或改變藥物作用性質(zhì)或降低其毒副作用的目的。
        薄層色譜獨有的特點是分析結(jié)果以直觀的彩色圖像表達，為其它色譜技術所不能。而圖像給出的多層面的信息是文字難以表達的，而且豐富多彩的圖像可以給分析者更多的思考和判斷的空間。
    白芷TLC色譜圖
(上圖樣品未熏硫;下圖樣品被硫熏過)
    陳皮TLC薄層色譜圖
    總之，因TLC法設備簡單，分析速度快，分離效率高，結(jié)果直觀，適合我國國情，能有效、直觀地反映藥品的真實性、穩(wěn)定性，現(xiàn)已成為中藥制劑的鑒別和質(zhì)量控制的行之有效的方法之一，很快被用作定性和半定量的方法。
   -2005年版收載薄層色譜鑒別1507項
   -2010年版新增薄層色譜鑒別2494項
技術要求
（1）在建立方法時，盡量采用以對照品和對照藥材或?qū)φ仗崛∥锿瑫r進行對照。當對照品不易獲得時，采用以對照藥材為對照；某些鑒別被測物為單一成分的，可以只采用對照品進行對照；不宜采用Rf值表述色譜行為。
（2）供試品溶液的制備應盡可能除去干擾色譜的雜質(zhì)，同時方法要盡量簡便，應視被測物的特性來選擇適宜的溶劑和方法進行提取、分離。
（3） 為了使圖譜清晰，斑點明顯，分離度與重現(xiàn)性符合要求，應根據(jù)被測物的特性選擇合適的固定相、展開劑及顯色方法等色譜條件。確定供試品取樣量、提取和純化方法、點樣量等條件；選擇合適的對照物質(zhì)，確定對照物質(zhì)用量、濃度、溶劑、點樣量等。
（4）由于實驗時的溫度、濕度常會影響薄層色譜結(jié)果，因此，建立方法時應對上述因素進行考察。如有必要，應在標準正文中注明溫、濕度要求。
（5）除需要改性，一般應采用預制的商品薄層板。不同品牌的薄層板或自制薄層板的薄層色譜結(jié)果有一定的差異，因此應對其進行考察選擇適宜的薄層板。
    白芷
RADIX ANGELICAE DAHURICAE
   ←異歐前胡素
   6. 生物鑒別
  (1) DNA鑒別
  DNA分子鑒定技術
 DNA分子鑒定技術是利用一種分子生物引物，引導DNA聚合酶在引物識別位點之間兩條互補鏈上進行DNA合成，經(jīng)過模板變形、引物復性及引物延伸三步反應的多次循環(huán)，可使特定DNA片段呈指數(shù)增加，即使待測品只有微量DNA 分子，都可充分擴增至數(shù)百個分子供鑒別和測定。
DNA分子鑒定技術
首次用于中藥標準中
新版藥典對于蛇類藥材物種鑒定采用了DNA分子鑒定技術
研究采用了試劑盒使操作時間大大縮短，精度提高
該方法的采用有力的遏制了困擾市場和監(jiān)督多年的假冒偽品問題。
 【鑒別】  聚合酶鏈式反應法(PCR)
 模板DNA提取  取本品粉末約0.5g，液氮中充分研磨使成粉末，取適量（約0.1g）至1.5mL離心管中，加入275μl消化液（細胞核裂解液200 μl，0.5M EDTA 50μl，蛋白酶K（20mg/ml）20μl，RNA酶溶液 5μl），55℃溫育1小時，入250μl Wizard SV Lysis Buffer混勻，加到柱中，10000r/min離心3分鐘；棄掉過濾液，加入800μl洗脫液（醋酸鉀162.8mM，Tris-HCl 22.6mM（pH7.5），EDTA 0.019mM（pH8.0），60% 乙醇），10000r/min離心1分鐘；棄掉過濾液，用洗脫液反復洗脫3次，每次10000r/min離心1分鐘；棄掉最后一次過濾液后再離心2分鐘，將過濾柱轉(zhuǎn)移入新的離心管中，加入100μl無菌雙蒸水，室溫放置2分鐘后，10000r/min離心2分鐘，濾液-20℃保存?zhèn)溆?。取對照藥材粉末約0.5g，同法制成對照藥材模板DNA溶液。
 
   PCR反應  鑒別引物：5’GGCAATTCACTACACAGCCAACATCAACT3’和5’CCATAGTCAGGTGGTTAGTGATAC3’。PCR反應體系：25μl反應體系包括10×PCR緩沖液2.5μl，dNTP（2.5mM）2μl，鑒別引物（10μM）各0.5μl，高保真Taq DNA聚合酶（5U./ μl）0.2μl，模板0.5μl，無菌雙蒸水19.3μl。PCR反應參數(shù)：95℃預變性5分鐘后，進行30次循環(huán)（95℃ 30秒，63℃ 45秒），后延伸72℃ 5分鐘。
 電泳檢測  用瓊脂糖凝膠電泳法，膠濃度為1％，膠中加入核酸凝膠染色劑GelRed；供試品與對照藥材鑒別PCR產(chǎn)物的上樣量分別為8μl，DNA分子量標記上樣量為2μl（0.5μg/μl）。電泳結(jié)束后，凝膠在凝膠成像儀上或紫外透射儀上觀察，供試品與對照藥材凝膠電泳圖譜在300-400bp之間應有單一條帶。
 供試品凝膠電泳圖譜中，在300-400bp之間應有單一條帶。
烏梢蛇PCR分子鑒定
酒烏梢蛇PCR分子鑒定
薄層-生物自顯影技術
     TLC生物自顯影是一種將薄層色譜分離和生物活性測定相結(jié)合的藥物篩選方法,具有操作簡單、耗費低、靈敏度和專屬性高等優(yōu)點,是一種快速測定生物活性的方法.可用于對具有抗菌/真菌,抑制膽堿酯酶以及清除自由基和抗氧化等活性的天然產(chǎn)物的篩選,可實現(xiàn)活性指導的提取分離.利用TLC生物自顯影,可測定單體活性化合物的最小抑制濃度(MID),通過與對照品的MID值比較,能夠推測該化合物活性的強弱.此外,利用TLC生物自顯影定性及定量的特征,還可對食物、水樣及動物組織中抗生素殘留量進行監(jiān)測.
薄層-生物自顯影技術
和生物活性測定相結(jié)合
使薄層色譜分離得到的結(jié)果，除了鑒別真?zhèn)沃猓€能知道其中哪些成分有生物活性。
新版藥典在生地黃、熟地黃等標準中應用。
1、DPPH 自由基清除活性
特征與指紋圖譜
  特征和指紋圖譜本質(zhì)上是藥典色譜技術在應用上的延伸；確能夠反映中藥內(nèi)在質(zhì)量的整體變化情況和質(zhì)量的均一程度；控制產(chǎn)品批與批間的穩(wěn)定切實可行。2005版收載高效液相色譜特征圖譜1項，2010版收載高效液相色譜特征圖譜11項，指紋圖譜11項。使整體性控制中藥質(zhì)量的方法學和實際應用方面有了大幅度的提高，確保中藥質(zhì)量的均一穩(wěn)定。
例:茵陳的特征圖譜
 【特征圖譜】 照高效液相色譜法（附錄VI D）測定。
 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗  以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑......
 參照物溶液的制備  取綠原酸對照品適量，精密稱定,加60%甲醇制成每1ml含0.1mg的溶液，即得。
 供試品溶液的制備  取對羥基苯乙酮含量測定項下供試品溶液，即得。
 測定法  分別精密吸取參照物和供試品溶液各5μl，注入液相色譜儀，測定。
 
供試品特征圖譜中應有7個特征峰，與參照物相應的峰為S峰，計算各特征峰與S峰的相對保留時間，其相對保留時間應在規(guī)定值的±5%之內(nèi)。規(guī)定值為0.509（峰1）、0.627（峰2）、1.000（峰S）、1.109（峰3）、2.045（峰4）、2.075（峰5）、2.367（峰6）.
檢查
   “檢查”系指對藥材及飲片的純凈程度、可溶性物質(zhì)、有害或有毒物質(zhì)進行的限量檢查，如水分、灰分、雜質(zhì)、毒性成分、重金屬及有害元素、農(nóng)藥殘留、黃曲霉毒素、二氧化硫等。
    雜質(zhì)檢查通常應進行全量測試；然后將雜質(zhì)混入樣品中，一并隨機抽取足量樣品粉碎后進行其他項目檢驗。
    除另有規(guī)定，飲片水分通常不得過13%；藥屑雜質(zhì)通常不得過3%。起草標準時當總灰分超過15%時不收入藥典。
黃曲霉毒素測定法
 2010年版藥典首次在附錄中新增黃曲霉毒素測定法、對易霉變的桃仁、酸棗仁、陳皮、胖大海、僵蠶等5種規(guī)定黃曲霉毒素測定，并規(guī)定每1000g含黃曲霉毒素B1不得過5μg，含黃曲霉毒素G2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素B2和黃曲霉毒素B1的總量不得過10μg。
 
黃曲霉毒素測定
  黃曲霉毒素（AFT）是一類化學結(jié)構(gòu)類似的化合物，均為二氫呋喃香豆素的衍生物。黃曲霉毒素是主要由黃曲霉(aspergillus flavus) 寄生曲霉 (a.parasiticus) 產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，在濕熱地區(qū)食品和飼料中出現(xiàn)黃曲霉毒素的機率最高。
 
   1993年黃曲霉毒素被世界衛(wèi)生組織(WHO)的癌癥研究機構(gòu)劃定為1類致癌物,是一種毒性極強的劇毒物質(zhì).黃曲霉毒素的危害性在于對人及動物肝臟組織有破壞作用,嚴重時,可導致肝癌甚至死亡.在天然污染的食品中以黃曲霉毒素B1最為多見,其毒性和致癌性也最強.
    黃曲霉毒素Bl的半數(shù)致死量為0.36毫克/公斤體重,屬特劇毒的毒物范圍(動物半數(shù)致死量<10毫克/公斤=它的毒性比氰化鉀大10倍,比砒霜大68倍).它引起人的中毒主要是損害肝臟,發(fā)生肝炎,肝硬化, 肝壞死等.臨床表現(xiàn)有胃部不適,食欲減退,惡心,嘔吐,腹脹及肝區(qū)觸痛等;嚴重者出現(xiàn)水腫,昏迷,以至抽搐而死.黃曲霉毒素是目前發(fā)現(xiàn)的最強的致癌物質(zhì).其致癌力是奶油黃的900倍,比二甲基亞硝胺誘發(fā)肝癌的能力大75倍,比3,4苯并芘大4000倍.它主要誘使動物發(fā)生肝癌,也能誘發(fā)胃癌,腎癌,直腸癌及乳腺,卵巢,小腸等部位的癌癥.
   B1是最危險的致癌物，經(jīng)常在玉米，花生，棉花種子，一些干果中常能檢測到。它們在紫外線照射下能產(chǎn)生熒光，根據(jù)熒光顏色不同，將其分為B族和G族兩大類及其衍生物。AFT目前已發(fā)現(xiàn)20余種。AFT主要污染糧油食品、動植物食品、部分中藥材等。其中以花生和玉米污染最嚴重。家庭自制發(fā)酵食品也能檢出黃曲霉毒素，尤其是高溫高濕地區(qū)的糧油及制品種撿出率更高。
黃曲霉毒素
黃曲霉毒素檢測標準的研究
桃仁（黃曲霉毒素）
 
 【檢查】 黃曲霉毒素  照黃曲霉毒素測定法（附錄Ⅸ V）測定。
 供試品溶液的制備  取本品粉末（過二號篩）5g，精密稱定，加入3g氯化鈉， 70%甲醇75ml，高速攪拌2分鐘（攪拌速度大于11，000轉(zhuǎn)/分），離心5分鐘（離心速度2500轉(zhuǎn)/分），精密吸取上清液10ml，用水稀釋至50ml，搖勻，離心5分鐘，上清液用玻璃纖維濾紙濾過，取續(xù)濾液20ml，通過免疫親合柱（流速3ml/min.），隨后用水20ml洗脫（流速6ml/min.），洗脫液棄去，再用1.5ml甲醇洗脫（流速1ml/min.），收集甲醇洗脫液，用水稀釋至2ml，搖勻，即得。
 本品每1000g含黃曲霉毒素B1不得過5µg，含黃曲霉毒素G2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素B2和黃曲霉毒素B1的總量不得過10µg。
 中藥材中二氧化硫殘留
  1.亞硫酸鹽對人體健康的影響
    中藥材經(jīng)硫磺熏蒸后，在這個處理過程中單質(zhì)硫生成二氧化硫與中藥材中無機元素生成亞硫酸鹽。亞硫酸鹽因其具有還原作用，可阻斷微生物的正常生理氧化過程。因而可以抑制微生物繁殖，可抑制水果中氧化酶的活力，防止氧化酶對營養(yǎng)成分的破壞和顏色的改變。故中藥材長期以來被用硫磺熏蒸，用于藥材的漂白、脫色、抗氧化和防腐。是有一定的科學依據(jù)，但尚若硫磺熏蒸操作隨意、無序過量使用，人體在攝入過多亞硫酸鹽時對腸胃、肝臟有損害，使紅血球紅蛋白減少。
 以白芍為例：中檢所曾檢測10批藥材,其中一批最高的二氧化硫殘留是2998mg/kg，最低的一批為0.0688mg/kg兩批相差5-6個數(shù)量級.
  以板藍根為例:檢測10批樣品,最高可達1967mg/kg最低0.0292 mg/kg，其中6批未檢出二氧化硫殘留。說明10批樣品中有四批被硫磺熏蒸過，其它6批未被硫磺熏蒸。板藍根藥材傳統(tǒng)上不熏蒸，檢出二氧化硫殘留可能是商家為使藥材外觀顏色好看，以次充好。
   
二氧化硫殘留的測定方法
1.比色法和蒸餾法
  食品中亞硫酸鹽（亞硫酸鹽以二氧化硫計）的測定,通行的方法是第一法鹽酸付玫瑰苯胺法和第二法蒸餾法。第一法鹽酸付玫瑰苯胺比色法是四氯汞鈉吸收，而吸收液中汞的殘留高，使用后廢液處理不當，對環(huán)境造成新的污染。第二法蒸餾法為經(jīng)典的方法其簡便、靈敏、快速易于普及。(GB/T5009.34-2003)
    二氧化硫殘留的測定方法
  2.離子色譜法
 離子色譜儀器性能先進，選擇性強。但儀器較昂貴，目前尚未普及、涉及中藥材，應用的分析領域較窄。針對中藥材中的二氧化硫殘留測定僅在做一些實驗基礎研究工作。

A  為兩頸蒸餾瓶1000ML；B為豎式冷凝器 固定在兩頸蒸餾瓶A上；
C 為（帶刻度）分液漏斗固定在兩頸蒸餾瓶A上；D 連接氮氣流入口；
E  為連接二氧化硫氣體至吸收液入口；
二氧化硫殘留量
  中藥材及飲片（礦物來源的中藥材除外）中亞硫酸鹽殘留量(以二氧化硫計）不得過150mg/kg，山藥、牛膝、粉葛、天冬、天麻、天花粉、白及、白芍、白術、黨參等10種中藥材及其飲片中亞硫酸鹽殘留量(以二氧化硫計）不得過400mg/kg。已收載進2010年版《中國藥典》第二增補本。
   藥材飲片檢測項目概況
重金屬檢查
石膏、白礬、玄明粉、地龍、芒硝、西瓜霜、龜甲膠、
冰片、鹿角膠、滑石粉等32種藥材及成藥。
砷鹽檢查
石膏、白礬、玄明粉、地龍、芒硝、冰片等15種。
重金屬及有害元素
山楂、丹參、甘草、白芍、西洋參、阿膠、金銀花、枸杞子、黃芪等17種（對用藥時間較長、或兒童常用藥品增加重金屬和有害元素檢查）。
有機氯農(nóng)藥殘留量
甘草、黃芪、人參莖葉總皂苷、人參總皂苷。
黃曲霉毒素檢查
陳皮、胖大海、桃仁、酸棗仁、僵蠶
樹脂殘留溶劑檢查
三七三醇皂苷、三七皂苷、燈盞花素
特殊雜質(zhì)檢查
大黃（土大黃苷）、西洋參（人參）等
含量測定
1. 含量測定成分的確定
首選有效或活性成分，如含有多種活性成分，應盡可能選擇與中醫(yī)用藥功能與主治相關成分。
為了更全面控制質(zhì)量，可以采用同一方法測定2個以上多成分含量，一般以總量計制訂含量限度為宜。
對于尚無法建立有效成分含量測定，或雖已建立含量測定，但所測定成分與功效相關性差或含量低的藥材和飲片，而其有效成分類別又清楚的，可進行有效類別成分的測定，如總黃酮、總生物堿、總皂苷、總鞣質(zhì)等的測定；
含揮發(fā)油成分的，可測定揮發(fā)油含量。
某些品種，除檢測單一專屬性成分外，還可測定其他類別成分，如五倍子測定沒食子酸及鞣質(zhì)；姜黃測定姜黃素及揮發(fā)油含量等。
應選擇測定原形成分，不宜選擇測定水解成分。
不宜采用無專屬性的指標成分和微量成分（含量低于萬分之二的成分）定量。
2. 含量測定方法
(1) 重量法
(2) 容量法
(3) 紫外-可見分光光度法
(4) 高效液相色譜法
(5) 氣相色譜法
(6) 毛細管電色譜法
(7) 薄層色譜掃描法
(8) 生物測定法
2. 含量測定方法的確定
  含量測定方法應具有專屬性，如測定方法無法做到專屬性而采用了某一種非專屬性的方法，則應用其他的分析方法來達到總體的專屬性。比如，可附加一種合適的鑒別試驗（如特征或指紋圖譜等）。
選用的分析方法應符合“中藥質(zhì)量標準分析方法驗證指導原則”的要求。
 3.供試品溶液制備方法選擇
（1）提取條件的確定,應對不同溶劑、不同提取方式、不同時間及不同溫度等條件進行比較，確定最佳條件，并提供研究數(shù)據(jù)。
（2）分離純化條件的確定，根據(jù)被測成分的性質(zhì)，對樣品溶液可進行適當?shù)姆蛛x純化以排除干擾物質(zhì)，如采用液-液萃取及聚酰胺、氧化鋁、硅膠、大孔吸附樹脂等色譜純化方法，并提供方法選擇的依據(jù)及相應的研究數(shù)據(jù)。
3. 含量測定方法學驗證
按現(xiàn)行版《中國藥典》附錄收載的“中藥質(zhì)量標準分析方法驗證指導原則”的要求進行方法學驗證。
準確度實驗，其回收率應在95%～105%范圍內(nèi)，其中對于一些前處理較復雜的方法，其回收率可在90%～110%范圍內(nèi)；RSD應小于5%；
精密度實驗的RSD應小于3% 。
線性范圍
耐用性
 含量測定方法學驗證
準確度 (accuracy)
回收率 (recovery)
提取率(extraction efficiency)
分離度(resolution）－峰純度、對稱性、與相鄰峰的分離度
響應(response)
精密度 (precision)
重復性 (repeatability)
再現(xiàn)性 (reproducibility)
分離度
指標成分色譜的分離度直接影響結(jié)果的準確性。
重點考察色譜蜂或斑點的純度
對稱性
峰寬
LC-MS
峰形不對稱、過寬也會影響結(jié)果的準確
重復性與再現(xiàn)性
重復性：同一個操作者對同批次樣品進行重復取樣分析  
再現(xiàn)性：不同的操作者在不同的實驗室進行相同批次樣品的分析—Intra-labs validation
關鍵影響因素
樣品的均勻度
對照品的均勻度－不同批次的對照品純度或晶型的不同會對分析結(jié)果產(chǎn)生很大影響！
經(jīng)驗：把結(jié)晶研成粉末，混勻后分裝可避免對照品的不均勻。
耐受性試驗
（ruggedness and robustness test)
分離介質(zhì)（色譜柱、薄層板，等）
溶媒的生產(chǎn)廠家、批號
實驗環(huán)境：溫度、濕度
儀器設備
操作人員
保留時間（Rf值）的允許波動范圍
準確度
提取率：避免被回收率的表面現(xiàn)象所蒙蔽
用選定的溶劑進行連續(xù)或多次回流提取，比較相鄰兩次提取的差異，或用多次提取的相對標準偏差來標示。
用回流提取的最大提取率與超聲提取法進行比較；
多次超聲，進行提取率的比較
4. 含量限幅度的制定
應根據(jù)藥材、飲片的實際情況來制定含量限(幅)度。一般應根據(jù)不低于10批樣品的測定數(shù)據(jù)，按其平均值的±20％作為限度的制定幅度，以干燥品來計算含量；
毒性藥材、飲片要制定限度范圍，根據(jù)毒理學研究結(jié)果及中醫(yī)臨床常用劑量，確定合理的上下限數(shù)值。
含量限度規(guī)定的方式，有以下幾種：
所測定成分為有效成分時可只規(guī)定下限。所測定成分為有毒成分時可作限量檢查，只規(guī)定上限。
所測定成分為有毒成分同時又為有效成分時必須規(guī)定幅度。
凡含有兩種以上的有效成分，而且該類成分屬于相互轉(zhuǎn)化的，可規(guī)定二種成分之和。
多植物來源的藥材、飲片，如外形能區(qū)分開而其含量差異又較大者，可制訂兩個指標。
關鍵：藥材、飲片的代表性！
【注意】 進行測定時，需要粉碎的藥材和飲片，應按各正文標準項下規(guī)定的要求粉碎過篩，并注意混合均勻。樣品粉碎通常在理化檢測前，現(xiàn)用現(xiàn)粉碎。尤其測定含揮發(fā)性物質(zhì)、易氧化、光不穩(wěn)定成分。粉碎時應使全部樣品通過規(guī)定藥篩，但不宜比規(guī)定粒度太細，否則易糊化或形成微球阻礙成分溶出。
中藥材、飲片質(zhì)量標準發(fā)展思路
(一) 進一步加強中藥材有效成分研究，為質(zhì)量標準的制定奠定物質(zhì)基礎
(二) 推廣以對照提取物為對照的藥材、飲片TLC鑒別
優(yōu)勢：
多成分對照，專屬性強
大批量生產(chǎn)，一致性、均一性強，成本低
微量化、芯片化，攜帶、使用方便，成本更低
說明書附TLC圖片，鑒定更加準確、明了
(三) 建立基于“特征圖譜”的藥材、飲片質(zhì)量控制方法
鑒別：專屬性強
品質(zhì)評價：半定量
(四) 推廣以標化提取物為對照的藥材、飲片多成分含量測定
制備簡單，成本低
定量化包裝，使用方便
節(jié)省對照品
說明書附色譜圖，色譜峰易于鑒別
(五) 進一步探索建立基于“一標多測”方法的藥材、飲片多成分含量測定
“一標多測”定義：采用一種化學對照品測定多種化學成分的含量，簡稱“一標多測”。 One single standard substance for the determination of multiple components (One for M)。
實際上是一種內(nèi)標的方法，在國際上已用于植物藥、食品、果酒等的多成分含量測定。
 研究方法：
方法學研究
計算測定化合物與對照品之間的校正因子(F)
優(yōu)勢：解決對照品缺乏問題；節(jié)省對照品；節(jié)省測定時間
(六) 繼續(xù)探索建立中藥生物測定法
方法準確性、重現(xiàn)性
測定周期
操作難度
檢測費用
與功能主治的相關性
(七) 進一步完善中藥材（飲片）質(zhì)量標準及其評價體系
中藥材、飲片質(zhì)量評價體系
(八) 建立中藥材（飲片）質(zhì)量標準數(shù)據(jù)庫及其信息平臺

（河南省食品藥品檢驗所  李振國）